La chetoacidosi diabetica (DKA) è l'emergenza iperglicemica più comune nei pazienti con diabete ed è causata da un eccesso di chetoni. Tra i corpi chetonici totali, l'acido D-3-idrossibutirrico (D-3-HB) è il principale, con quasi il 78%. Pertanto, il rilevamento del D-3-HB sierico è stato un marker di routine per la diagnosi della chetoacidosi diabetica. Il rilevamento fluorescente è il metodo più efficiente, semplice da utilizzare, economico, in grado di monitorare in tempo reale e altamente sensibile. In questo studio sono state sintetizzate due nuove sonde, 4-(2-idrossibenzilene)tiosemicarbazide (1) e 4-(1H-imidazo[4,5-f][1,10]-fenantrolin-2-il)fenolo (2), che hanno mostrato una peculiare risposta fluorescente OFF-ON al D-3-HB in soluzione acquosa. Le sonde 1 e 2 hanno mostrato una risposta selettiva e sensibile al D-3-HB rispetto ad altri ioni metallici, anioni e aminoacidi comuni. Inoltre, il meccanismo è stato confermato mediante 1H-NMR ed ESI-MS. Inoltre, la sonda 1 è stata applicata con successo alla bioimmaginografia, dimostrando il suo valore per applicazioni pratiche nei sistemi biologici.